Giovanni Antonini wurde in Mailand geboren und studierte an der Civica Scuola di Musica und am Centre de Musique Ancienne in Genf. Er ist Gründungsmitglied des Barockensembles Il Giardino Armonico, das er seit 1989 leitet. Mit diesem Ensemble trat er als Dirigent und Solist auf der Blockflöte und Traversflöte in Europa, den Vereinigten Staaten, Kanada, Südamerika, Australien, Japan und Malaysia auf. Er ist künstlerischer Leiter des Wratislavia Cantans Festival in Polen und erster Gastdirigent des Kammerorchesters Basel.

Er arbeitete mit vielen renommierten Künstlern zusammen, darunter Cecilia Bartoli, Kristian Bezuidenhout, Giuliano Carmignola, Isabelle Faust, Sol Gabetta, Sumi Jo, Viktoria Mullova, Katia und Marielle Labèque, Emmanuel Pahud und Giovanni Sollima. Giovanni Antonini ist bekannt für seine raffinierten und innovativen Interpretationen des klassischen und barocken Repertoires und ist regelmäßig zu Gast bei den Berliner Philharmonikern, dem Concertgebouworkest, dem Tonhalle Orchester, dem Mozarteum Orchester, dem Gewandhausorchester Leipzig, dem London Symphony Orchestra, der Tschechischen Philharmonie und dem Chicago Symphony Orchestra.

Zu seinen Opernproduktionen gehören Händels Giulio Cesare in Egitto und Bellinis Norma mit Cecilia Bartoli bei den Salzburger Festspielen. Im Jahr 2018 dirigierte er Orlando am Theater an der Wien und kehrte für Idomeneo an das Opernhaus Zürich zurück. 2019 dirigierte er Guilio Cesare und 2021 Così fan tutte an der Scala.  Auch ans Theater an der Wien kehrt er 2021 mit Cavalieris Rappresentatione di Anima, et di Corpo zurück. Zu Beginn der Spielzeit 24-25 ist Giovanni Antonini erneut an der Scala, um Robert Carsens L'Orontea zu dirigieren. Er setzt die Saison mit Gegenbesuchen bei den Berliner Philharmonikern, der Tschechischen Philharmonie, dem Orchestre de Chambre de Paris, dem Tonhalle Orchester Zürich und den Bamberger Symphonikern fort. 

Mit Il Giardino Armonico nahm Giovanni Antonini zahlreiche CDs mit Instrumentalwerken von Vivaldi, J.S. Bach (Brandenburgische Konzerte), Biber und Locke für Teldec auf. Mit Naïve nahm er Vivaldis Oper Ottone in Villa auf und für Decca spielte er 2 CDs mit Julia Lezhneva ein. Bei Alpha Classics (Outhere Music Group) veröffentlichte er verschiedene Alben, darunter La Morte della Ragione; seinem Interesse an Musik der Renaissance durch Sammlungen von Instrumentalmusik aus dem 16. und 17. Jahrhundert nachfolgend. Mit dem Kammerorchester Basel hat er die gesamten Beethoven-Sinfonien für Sony Classical aufgenommen und mit Emmanuel Pahud eine CD mit Flötenkonzerten unter dem Titel Revolution für Warner Classics.

Giovanni Antonini ist der künstlerische Leiter des Projekts Haydn2032, das mit dem Ziel ins Leben gerufen wurde, bis zum 300. Geburtstag des Komponisten mit Il Giardino Armonico und dem Kammerorchester Basel sämtliche Sinfonien von Joseph Haydn aufzunehmen und aufzuführen. Nach etwa der Hälfte des Projekts sind die ersten fünfzehn Bände beim Label Alpha Classics erschienen.